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技術文章

PCR基因擴增儀的工作原理

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基因擴增儀性能,能滿足不同工作環(huán)境的多種需求??捎米饕跃酆厦告準椒磻獮樘卣鞯?、以檢測DNA/RNA為目的的各種病原體檢測及基因分析?;驍U增儀廣泛應用于分子生物學、醫(yī)學、食品工業(yè)、司法科學、生物技術、環(huán)境科學、微生物學、臨床診斷、流行病學、遺傳學、基因芯片、基因檢測、基因克隆、基因表達等領域。

基因擴增儀性能,能滿足不同工作環(huán)境的多種需求。可用作以聚合酶鏈式反應為特征的、以檢測DNA/RNA為目的的各種病原體檢測及基因分析。基因擴增儀廣泛應用于分子生物學、醫(yī)學、食品工業(yè)、司法科學、生物技術、環(huán)境科學、微生物學、臨床診斷、流行病學、遺傳學、基因芯片、基因檢測、基因克隆、基因表達等領域。

1、基因擴增的基本要素

  基因擴增的基本要素與DNA復制的基本要素是一致的。

 ?、貲NA模板:待拷貝的DNA稱為模板,它可以是雙鏈DNA也可是單鏈DNA,后擴增得到的產(chǎn)物是雙鏈狀態(tài)的。

 ?、谝铮菏荄NA復制的先鋒,就象結晶過程中的晶核,引導DNA的合成。在PCR擴增中一般使用合成的寡核苷酸作引物。

 ?、跠NA聚合酶(TaqDNA聚合酶):是DNA復制的動力,在dNTP等底物存在時在引物的引導下沿著模板DNA合成互補的DNA鏈。

  ④緩沖液:提供DNA合成反應所需的pH,離子強度等環(huán)境。

 ?、?種單核苷酸:dNTP,提供DNA合成原料。

2、基因擴增儀原理

  基因擴增儀是利用PCR技術對特定基因做體外的大量合成,用于以檢測DNA/RNA為目的的各種基因分析。

  PCR反應一般設置20~40次循環(huán),每一循環(huán)包括高溫變性、低溫退火、中溫延伸三步反應。每一循環(huán)的產(chǎn)物作為下一個循環(huán)的模板。PCR的擴增效率很高,如果循環(huán)次數(shù)是30次,那么新生DNA片段理論上達到230拷貝(約為109個分子)。PCR反應每個循環(huán)的三個基本反應步驟如下:

  ①模板DNA的變性:模板DNA經(jīng)加熱至94℃左右一定時間后,使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴增形成的雙鏈DNA產(chǎn)物解離,使之成為單鏈,以便它與引物結合,為下輪反應作準備;

 ?、谀0錎NA與引物的退火(復性):模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后,溫度降至55℃左右,引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結合;

  ③引物的延伸:溫度升到72℃左右,DNA模板-引物結合物在TaqDNA聚合酶的作用下,以dNTP為反應原料,靶序列為模板,按堿基配對與半保留復制原理,合成一條新的與模板DNA鏈互補的半保留復制鏈。重復循環(huán)變性-退火-延伸三過程,就可獲得更多的“半保留復制鏈”,而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個循環(huán)需2~4分鐘,2~3小時就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍。到達平臺期所需循環(huán)次數(shù)取決于樣品中模板的拷貝。

基因擴增儀的用途

  基因擴增儀靈敏度高,操作起來簡便、快捷,加上對特定基因樣本純度要求低,因而被廣泛地運用在以下檢測活動中:

  1、醫(yī)學和健康檢驗機構臨床診斷,用于判斷檢體中是否會表現(xiàn)某遺傳疾病的圖譜、傳染病的診斷以及基因復制。

  2、DNA鑒定,常見于司法鑒定領域。

  3、臨床分子診斷試劑和生物試劑公司藥品研發(fā)。

  4、轉(zhuǎn)基因、微生物、動物源性成分檢測,常見于醫(yī)藥衛(wèi)生及農(nóng)產(chǎn)品檢驗領域。

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